HEPENGBIO細胞NADPH氧化酶活性光度法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

HEPENGBIO細胞NADPH氧化酶活性光度法定量檢測試劑是一種旨在使用特異性抑制劑，通過反應系統測定樣品中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化后峰值的降低，即采用光度法測定樣品中酶活性的而經典的方法。該經過心研制、成功實驗證明的。其適合于細胞樣品（動物或人體）還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH氧化酶）的特異活性檢測。用于免疫、血液研究、蛋白組學、病理生理學等研究。產品不含污染性蛋白酶，嚴格，即到即用，操作簡捷，性能穩定，反應優化，檢測敏感。

背景

NADPH氧化酶，通常稱為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase；NADPH oxidase；EC1.6.3.1）或還原型輔酶II氧化酶，是機體御機制中的重要元素。NADPH氧化酶由6個亞體構成：Rho GTP酶（Rho guanosine triphosphatase）和5個phox（吞噬細胞氧化酶；phagocytic oxidase）。其中主要包含細胞膜嵌合蛋白質分子（gp91phox、p22phox、flavocytochrome b558等），以及位在細胞質內的蛋白質分子（p47phox、p67phox、p40phox、Rac1、Rac2等）。其特征性的酶活性是超氧化物歧化酶敏感的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶。細胞膜上的NADPH氧化酶被激活，將還原型輔酶Ⅱ（NADPH）轉變為氧化型輔酶Ⅱ（NADP），氧分子則獲得電子形成超氧陰離子O2-，由O2-又可生成H2O2和OH－。其超氧陰離子產物具有殺死微生物的功能。NADPH氧化酶異常將導致慢性肉芽腫?。–hronic Granulomatous Disease；CGD）?；诘孜镞€原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），在特異性抑制劑聯苯基三價碘（diphenyleneiodonium；DPI）的存在下，受到NADPH氧化酶的催化作用，轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP），產生吸光峰值的變化，通過分光光度儀（340nm波長）檢測，來測定NADPH氧化酶的特異活性。其反應方式為：   

           
產品內容

HEPENGBIO清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO緩沖液（Reagent C） 毫升
HEPENGBIO反應液（Reagent D） 毫升
HEPENGBIO陰性液（Reagent E） 毫升
HEPENGBIO底物液（Reagent F） 微升
HEPENGBIO專性液（Reagent G） 微升
產品說明書   1份



保存方式

保存HEPENGBIO清理液（Reagent A）和HEPENGBIO陰性液（Reagent E）在4℃冰箱里，其余的保存在在－20℃冰箱里，避免反復凍融；HEPENGBIO反應液（Reagent D）和HEPENGBIO底物液（Reagent F），避免光照，有效6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器
細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離
DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞
4℃（微型）臺式離心機：用于樣品處理
恒溫培養箱或恒溫水槽：用于反應物孵育
比色皿：用于光度測定的容器
分光光度儀：用于光度分析

實驗步驟
 
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；HEPENGBIO反應液（Reagent D）和HEPENGBIO底物液（Reagent F）注意避光。然后進行下列操作。

一、樣品準備

1．準備好75cm2細胞培養瓶或100mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 107細胞）
2．小心加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
3．小心抽去清理液
4．使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
5．加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻細胞
6．移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
7．放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
8．小心抽去上清液
9．加入xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B），充分混勻
10．轉移到預冷的DOUNCE勻漿器
11．在冰槽里用勻漿棒勻化細胞（約40下）
12．將細胞勻漿物移入到預冷的1.5毫升離心管
13．強力渦旋震蕩15秒
14．置于冰槽里孵育30分鐘
15．放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
16．小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
17．移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－HEPENGBIO30030.1）
18．即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

二、測定準備

1．從-70℃取出待測樣品（例如細胞裂解懸液樣品等），置于冰槽里 
2．設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔30秒，讀數5次（共2分鐘），并置零 
3．HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）室溫預熱

三、背景對照測定

1．移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入xx微升HEPENGBIO反應液（Reagent D）
3．加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
4．放進30℃培養箱里靜置3分鐘
5．加入xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent E）
6．上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
7．即刻放入分光光度儀檢測，此為背景空對照：（340波長讀數）0分鐘－（340讀數）2分鐘 

四、樣品總活性測定

1．移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入xx微升HEPENGBIO反應液（Reagent D）
3．加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
4．放進30℃培養箱里靜置3分鐘
5．加入100微升待測樣品（注意：300至350微克細胞裂解懸液蛋白；樣品須溶解）
6．上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
7．即刻放入分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數：（340波長讀數）0分鐘－（340讀數）2分鐘

五、樣品非特異活性測定

1．準備1個1.5毫升離心管
2．加入xx微升HEPENGBIO專性液（Reagent G）
3．加入100微升待測樣品（注意：300至350微克細胞裂解懸液蛋白；樣品須溶解）
4．放進30℃培養箱里靜置5分鐘
5．放進冰槽里備用
6．移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
7．加入xx微升HEPENGBIO反應液（Reagent D）
8．加入20微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
9．放進30℃培養箱里靜置3分鐘
10．加入上述冰槽里的xx微升含有HEPENGBIO專性液（Reagent G）和待測樣品的溶液  
11．上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
12．即刻放入分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數：（340波長讀數）0分鐘－（340讀數）2分鐘




六、計算樣品活性

1）樣品總活性和非特異活性


2）樣品特異活性


注意事項

1．本產品為21次（10個樣本）操作，包括1次背景對照測定
2．操作時，須戴手套
3．HEPENGBIO反應液（Reagent D）和HEPENGBIO底物液（Reagent F）注意避光
4．系統操作過程中，背景測定只需1次
5．樣品檢測前，須溶解和澄清 
6．加樣后3秒內進行光度測定
7．建議使用分光光度儀檢測
8．光度測定后，比色皿須清洗
9．樣品0秒讀數通常和背景空對照0秒讀數一致；如果為總蛋白樣品，樣品0秒讀數通常大于背景空對照0秒讀數
10．反應測定值由高到低變化；測定持續2分鐘
11．測定值由高到低變化，表明有酶活性
12．建議待測樣本蛋白濃度為300至350微克/100微升；如果樣本酶活性過低，則可以增加樣本量（本公司提供HEPENGBIO Bradford蛋白質濃度定量試劑盒HEPENGBIO30030.1）
13．如果使用純化目標蛋白，則蛋白濃度為1至5微克/100微升；如果使用純化膜蛋白，則蛋白濃度為10微克/100微升
14．樣品實際活性是指聯苯基三價碘（diphenyleneiodonium；DPI）敏感的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，去除其它干擾因素 
15．NADPH氧化酶活性單位濃度定義：在30℃室溫下，pH 7.0的情況下，每單位酶在單位時間內（每分鐘）氧化1微摩爾的還原型輔酶Ⅱ（NADPH）
16．本公司提供系列氧化酶類分析產品